ACS Nano（IF=15.8）：“中药复方组分配伍”的多组分自组装水凝胶体系改善脑损伤

创伤性脑损伤（TBI）是一种常见的神经系统疾病，其高致残率和致死率给社会和家庭带来了沉重的负担。目前，临床上对于TBI的治疗手段有限，效果也不尽如人意。因此，寻找新的治疗方法成为了医学界亟待解决的问题。中药作为中国传统医学的瑰宝，其丰富的药物资源和独特的药效机制为TBI的治疗提供了新的可能。中药复方是中医临床治疗的主要形式和手段。组分中药是在遵循中药方剂配伍理论的前提下、立足于中医药理论、由有效组分配伍而成的现代中药复方。大黄黄连泻心汤出自《伤寒论》，由后世《云歧子保命集》进一步完善发展，确定由大黄、黄连和甘草组成，能逐瘀泻火，切中创伤性脑损伤关键病机。大黄酸-黄连素-甘草酸是大黄黄连泻心汤的有效配伍组分。基于此，中南大学湘雅医院中西医协同医工交叉团队不断深入研究组分中药组装体，创新性地研制“中药复方组分配伍”水凝胶体系。2024年10月9日，中南大学湘雅医院王杨团队在ACS Nano（IF=15.8）上发表了题为“源自中药的小分子水凝胶负载小分子药物用于改善创伤性脑损伤治疗（Small molecule hydrogels loading small molecule drugs from Chinese medicine for enhanced treatment of traumatic brain injury ）”的文章，在生理条件下制备了一种由大黄酸——黄连素——甘草酸中药小分子多组分自组装水凝胶体系。该多组分水凝胶完全由多种中药天然小分子自组装而成（称为甘草酸G-黄连素B-大黄素R，GBR-凝胶），无外源性非活性成分或金属离子的参与，具有可注射性及最佳脑膜量适配性。此外，由中药复方配伍衍生的大黄酸-黄连素-甘草酸多组分配伍水凝胶（GBR-凝胶）能够增强谷氨酸能突触通路，从而维持正常的神经元活动，支持少突胶质前体细胞（OPCs）的分化和成熟，最终抑制脑内炎症反应，为在TBI急性期实现局部给药提供了一种有前景的策略。

在创伤性脑损伤（TBI）的应用中，通过损伤区局部注射以凝胶形式填充破损伤口并实现及时止血。借助单细胞测序研究发现，该多组分水凝胶能显著改善创伤性脑损伤后少突胶质前体细胞的相对比例。进一步分析表明，多组分水凝胶通过增强谷氨酸能突触通路协同改善“谷氨酸能神经元——少突胶质前体细胞——下一个谷氨酸能神经元”三方单元功能，从而促进少突胶质前体细胞（OPCs）的分化和成熟、增强髓鞘保护和轴突再生、抑制神经炎症以发挥整体神经保护效应，为在TBI急性期实现局部给药提供了一种有前景的策略（Scheme 1）。

Scheme 1：自组装小分子水凝胶局部给药增强TBI治疗的示意图

注：王杨，中南大学湘雅医院学科建设办/中西医结合科，特聘教授，研究员，博士生导师，主要研究方向为纳米中医药交叉研究；以第一作者/通讯作者在Nat Comm、Adv Mater、Adv Func Mater等发表中医药领域高水平论文40余篇；团队诚邀“中医药纳米交叉科学”领域博士后加盟；联系Email: wangyang_xy87@csu.edu.cn。

1、GBR凝胶在TBI治疗中的制备、优化、筛选与表征

作者首先开发了一种由大黄素、黄连素和甘草酸自然小分子自组装而成的水凝胶，以增强TBI的治疗。在制备的多种水凝胶中，BR粒子溶液、G-凝胶和GBR-凝胶的宏观形态各异，其中GBR-凝胶呈均匀黄色且长时间储存后外观无变化。微观上，BR溶液以纳米粒子形式存在，GBR-凝胶则形成多孔网络结构负载BR粒子。GBR-凝胶具有优异的可注射性和高效的药物释放性能，有助于及时干预TBI。流变特性评估显示，GBR-凝胶在应变超过11%时由凝胶转变为溶液状态，且性能在多次循环中可恢复，体现了其自愈合性能。这些特性使GBR-凝胶在局部给药和治疗TBI方面具有潜在应用价值（图1）。

图1 GBR凝胶的制备、优化、筛选与表征

2、GBR-凝胶的自组装机制

接着，作者探究了GBR-凝胶的自组装过程，通过圆二色性光谱、质谱、透射电子显微镜等多种技术手段进行检测发现，BR粒子的加入并未破坏甘草酸的组装，且GBR-凝胶中存在大黄素-黄连素复合物以及甘草酸单体。随着GBR-凝胶浓度的增加，UV-vis光谱发生蓝移，表明水凝胶内部存在π-π堆叠相互作用，这一发现得到了X射线衍射图谱的进一步支持。此外，通过¹H核磁共振光谱和傅里叶变换红外光谱，证实了三种组分成功组装成了GBR-凝胶，且存在氢键和π-π堆叠等相互作用。结果阐明了GBR-凝胶的自组装过程：首先通过大黄素和黄连素之间的非共价相互作用形成粒子，然后这些粒子通过甘草酸自组装形成的纤维结构中的氢键悬浮，最终通过交联形成多组分结构的自组装GBR-凝胶，BR粒子附着在表面（图2）。

图2 GBR-凝胶的自组装机制

3、GBR-凝胶局部给药治疗TBI的总体疗效优于G-凝胶

作者接着在可控性皮层撞击(CCI)诱导的TBI模型中，局部给药的GBR凝胶和G凝胶被评估它们的治疗效果，发现与CCI组相比，GBR凝胶显著改善神经功能缺损，但仅GBR凝胶在第7天持续有效。此外，GBR凝胶能减轻CCI导致的神经元坏死和核溶解，显著增加存活神经元数量，并显著减少凋亡神经元数量，而G凝胶效果不显著。结果表明GBR凝胶在TBI治疗中展现出更显著的整体疗效（图3）。

图3 GBR-凝胶局部给药治疗TBI的总体疗效优于G-凝胶

4、GBR-凝胶相比G-凝胶在TBI后表现出更优的抗炎性能 

炎症在加剧TBI后的神经损伤和其他继发性损伤中起着关键作用。作者为了比较GBR凝胶和G凝胶的抗炎效果，通过检测了星形胶质细胞、小胶质细胞标志物及炎症因子表达发现，GBR凝胶显著减少了第7天损伤皮质中过度激活的星形胶质细胞和小胶质细胞，并显著降低IL-6、IL-1β和TNF-α水平，而G凝胶效果不显著。结果表明局部应用GBR凝胶在TBI后具有更优越的抗炎效果，而G凝胶在处理TBI复杂脑微环境中的炎症反应方面未显示实质性改善（图4）。

图4 GBR-凝胶相比G-gel在TBI后表现出更优的抗炎性能

炎症是加剧TBI后继发性脑水肿的关键因素，作者进一步研究发现，与CCI组相比，GBR凝胶治疗能显著增加脑湿重/干重比，减轻脑水肿。MRI扫描显示，GBR凝胶能降低CCI诱导的小鼠在T2加权图像中的高信号范围，T2映射也提供了更直观的可视化效果。此外，GBR凝胶还能降低AQP-4与GFAP的共定位程度，进一步减轻脑损伤后的水肿。结果表明GBR凝胶表现出卓越的抗炎活性，并有效缓解了TBI后的继发性脑水肿，为TBI的治疗提供了新的思路（图5）。

图5 GBR-凝胶减轻TBI后的炎症相关性脑水肿

5、GBR-凝胶减轻TBI对少突胶质前体细胞（OPC）分化的抑制作用

接着，作者探究了GBR凝胶在TBI后的作用机制，对假手术组、CCI组和GBR凝胶组小鼠进行了单细胞RNA测序，发现与假手术组相比，CCI增加了OPC（少突胶质细胞前体细胞）的比例，但GBR凝胶逆转了这一变化。伪时间轨迹分析显示GBR凝胶能缓解TBI后未分化前体细胞的异常状态，促进OPC分化为OLG（少突胶质细胞）。此外，GBR凝胶在体内促进OPC分化、髓鞘形成和轴突再生的能力。与假手术组相比，CCI模型周围损伤皮质中成熟OLG标志物CC1+/Olig2+细胞比例降低，而GBR凝胶显著增加了这种细胞类型。GBR凝胶还上调了髓鞘蛋白脂蛋白（PLP）和神经丝蛋白NF-H的表达，对轴突再生具有保护作用。结果表明GBR凝胶通过促进OPC的分化和成熟，促进了TBI后的髓鞘形成和轴突再生（图6）。

图6 GBR-凝胶减轻TBI对少突胶质前体细胞（OPC）分化的抑制作用

6、GBR-凝胶通过Gria2和Grin2b增强谷氨酸能突触通路

前面研究发现，GBR凝胶对维持正常神经元活动和促进OPC分化有显著作用，并通过单细胞RNA测序，观察到GBR凝胶治疗后谷氨酸能神经元比例增加。与假手术组和CCI组相比，GBR凝胶组在谷氨酸能神经元和OPC中鉴定出多个差异表达基因，进一步富集分析显示，GBR凝胶主要通过上调特定基因及相关通路来发挥作用，其中谷氨酸突触通路最为突出。结果表明GBR凝胶通过增强谷氨酸突触通路来促进OPC的分化和成熟。GBR凝胶治疗后，OPC通过Slc1a2转运体摄取谷氨酸，维持其分化功能，并减轻TBI后的谷氨酸毒性。同时，谷氨酸在谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶的作用下，形成谷氨酰胺并被运回谷氨酸能神经元，补充其正常生理活动所需的谷氨酸。此外，GBR凝胶还上调了谷氨酸能神经元中Gria2和Grin2b的表达，这两种受体对维持中枢神经系统信号传导至关重要。同时，GBR凝胶也上调了关键的VGLUTs（如Slc17a7）的表达，这对谷氨酸能神经传递至关重要。一致地，TBI小鼠中Gria2+/Slc17a7+和Grin2b+/Slc17a7+细胞的数量显著减少，而GBR凝胶小鼠中则增加（图7）。

图7 GBR-凝胶给药增强了谷氨酸能突触通路

总结

该研究报道了一种装载小分子药物（甘草酸、小檗碱和大黄碱）的小分子水凝胶（GBR-gel），该凝胶起源于流行的中药，在生理条件下没有额外的药物装载或非活性成分。从长远来看，gbr凝胶具有制备简单、成本效益高、生物相容性高等优点。作为概念验证，gbr凝胶允许在脑损伤部位及时给药，以发挥有效的药效学作用。进一步的单细胞RNA测序和实验验证表明，gbr -凝胶可以有效地挽救TBI后被抑制的谷氨酸突触通路，从而减轻炎症反应和神经损伤。研究工作为及时干预TBI提供了另一种策略。由中药复方配伍衍生的大黄酸-黄连素-甘草酸多组分配伍水凝胶体系可能克服传统中药煎煮复杂、口感苦涩、难以透过血脑屏障的瓶颈难题，是对课题组以往单一中药小分子大黄酸自组装水凝胶、中药组分药对芦丁-芒果苷自组装水凝胶的进一步优化和突破，是中药现代化二次开发的重要体现之一。

图8 “中药复方组分配伍”的多组分自组装水凝胶体系改善脑损伤

参考文献

Luo W, Yang Z, Zheng J, Cai Z, Li X, Liu J, Guo X, Luo M, Fan X, Cheng M, Tang T, Liu J, Wang Y. Small Molecule Hydrogels Loading Small Molecule Drugs from Chinese Medicine for the Enhanced Treatment of Traumatic Brain Injury. ACS Nano. 2024 Oct 9. doi: 10.1021/acsnano.4c09097. Epub ahead of print. PMID: 39383335.